알츠하이머의β-아밀로이드응집체의자기전기해리

출처 : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn1675  영어원본 클릭해서 보시면 됩니다.

JANG, Jinhyeong; PARK, Chan Beum. Magnetoelectric dissociation of Alzheimer’s β-amyloid aggregates. Science Advances, 2022, 8.19: eabn1675.

알츠하이머질환을 유발하는 베타-아밀로이드 펩타이드(아미노산 화합물) 응집체를 자기장으로 분해하는 것을 확인했다고 설명했다.

그림 3 . BCFO 나노 입자의 자기 특성. 

( A ) 저주파 자기장 조사에 대한 응답으로 BCFO 나노 입자에서 변형 구동 여기 전하 캐리어 생성의 개략도. ( B ) 자기장 강도 범위가 -5 ~ +5 T인 실온(RT)에서 BCFO, CFO 및 BFO 나노입자의 자기 히스테리시스 곡선. ( C ) 전하 캐리어 생성 및 ( D) 저주파 자기장(1kHz 및 13.6mT)의 영향으로 BCFO, CFO 및 BFO 나노입자 용액의 시스템 온도 변화. 1시간 동안 저주파 자기장을 자극한 후, 나노입자로부터 정공과 전자의 상대적 생성량을 각각 테레프탈산(TA)과 디히드로에티듐(DHE) 분석법으로 측정하였다. 나노 입자가 없는 상태에서 온화한 온도 변화는 주변 전자석의 전기 저항 효과에서 파생되며 전자석을 냉각하여 낮출 수 있습니다(약한 온도 변화에 대한 자세한 내용은 그림 S9 참조).

우리는 저주파 자기장(예: 1kHz 미만)이 생성된 전하 캐리어를 통해 BCFO 나노 입자 표면에서 촉매 작용을 유발한다고 가정했습니다. 자기전기적으로 구동되는 화학 반응의 출현을 조사하기 위해 우리는 디히드로에티듐(DHE) 및 테레프탈산(TA) 분석을 테스트했습니다. 

DHE assay는 전자이동 반응을 통해 2-hydroxyethidium의 발생을 검출하고, TA assay는 정공이동 과정에 따라 2-hydroxyterephthalic acid의 생성을 조사한다(fig. S7)( 28 , 35 ). 우리는 여기된 전하 캐리어가 저주파 자기장(1kHz 및 13.6mT) 하에서 CFO 나노입자의 것보다 약 4.2배 더 BCFO 나노입자의 표면에서 반응물(즉, DHE 및 TA)로 이동한다는 것을 발견했습니다.도 3c ). BCFO 나노입자의 전하 이동 속도는 용액에 적용된 교류 자기장의 강도(4.6, 9.2, 13.6mT)와 주파수(0.25, 0.5, 1kHz)에 비례했습니다(그림 S8). BCFO 나노입자는 저주파 자기장 조사 시 무시할 수 있는 양의 열을 발생시켰다( 그림 3D 및 그림 S9). BCFO 나노 입자에 의한 미미한 열 방출은 고주파 자기장(예: 5~500°C)의 유도 가열 효과("자기 온열 요법"이라고도 함)와 관계없이 저주파 자기장(1kHz 미만)에서 자기전기 촉매가 발생함을 시사합니다. kHz) ( 22). 따라서 우리는 저주파 자기장에 의해 유발되는 자기전기 촉매가 열적 부작용 없이 뇌와 같은 극도로 섬세한 연조직의 치료에 적합하다고 생각했습니다. 

매우 안정적인 β 시트가 풍부한 Aβ 원섬유는 Aβ 플라크의 주요 단백질 성분으로 알츠하이머병 환자의 뇌에서 시냅스 기능 장애와 신경 세포 변성을 유발 합니다 . 우리는 저주파 자기장에서 Aβ 원섬유를 해리하기 위한 BCFO의 자기전기 결합 효과의 가능성을 조사했습니다( 그림 4A ). 우리 는 24시간 동안 수용액에서 37°C에서 단량체 Aβ 42 펩타이드를 배양하여 성숙한 Aβ 원섬유를 준비했습니다. Ex situ AFM(원자력현미경) 이미지( 그림 4B , AFM 프로파일은 그림 S10 참조)에서 볼 수 있듯이 자가 조립된 Aβ 원섬유는 길이가 수 마이크로미터이고 두께가 나노미터로 특징적인 형태와 일치합니다( 37). BCFO 나노입자(100μg ml -1 ) 또는 저주파 자기장(1kHz 및 13.6mT)을 Aβ 원섬유 용액(30μM)에 6시간 동안 적용했을 때, 많은 Aβ 원섬유가 아무런 변화 없이 여전히 관찰되었습니다. 뚜렷한 형태적 변화. 대조적으로, BCFO 나노입자가 있는 상태에서 저주파 자기장을 조사한 후 소량의 구형 Aβ 파편(직경 약 100nm)만이 발견되었습니다. 구형 Aβ 파편의 주사 전자 현미경(SEM) 및 TEM 이미지는 AFM 이미지와 일치했습니다(그림 S11).

그림 4 . Aβ 원섬유의 구조적 변화. 

( A ) BCFO 나노입자와 저주파 자기장(MF)을 사용한 Aβ 원섬유의 자기전기적 해리의 개략도. ( B ) 원자력 현미경(AFM) 이미지(5 μm x 5 μm), ( C ) 티오플라빈 T(ThT) 분석 결과, ( D ) BCFO 처리 후 Aβ 원섬유(30 μM)의 원형 이색성(CD) 스펙트럼 6시간 동안 저주파 자기장(13.6 mT 및 1 kHz)의 영향 하에 나노입자(100 μg ml -1 ). AFM 이미지에서 BCFO 나노입자가 있는 조건의 큰 종은 BCFO 나노입자 집합체를 나타냅니다(Aβ 원섬유 및 파편에 대한 AFM 이미지의 너비 및 높이 프로필은 그림 S10 참조). 

우리는 Aβ 섬유소의 급격한 형태학적 변화가 Aβ 섬유소의 구조적 견고성을 구축하는 2차 구조의 손상으로 인해 발생했다고 가정했습니다. 우리는 Aβ 원섬유에서 β 시트 구조의 변화를 평가하기 위해 thioflavin T(ThT) 분석과 원형 이색성(CD) 분석을 적용했습니다. 

ThT는 β 시트 구조에 결합하여 강한 형광을 방출하기 때문에 아밀로이드 응집 정도를 평가하기 위한 금 표준 염료입니다(ThT 분석의 대표적인 형광 이미지는 그림 S12 참조)( 38 ). 도 4c 에 도시된 바와 같이그리고 무화과. S13, ThT 형광 강도는 BCFO 나노 입자의 존재 하에 6시간 동안 저주파 자기장 조사 후 1.00에서 0.36으로 현저히 감소하여 Aβ 원섬유에서 β 시트 구조의 해리를 의미합니다. 우리는 ThT 분석 결과를 분광학적으로 지원하기 위해 Aβ 원섬유 용액의 CD 스펙트럼을 추가로 수집했습니다. 도 4D 에 도시된 바와 같이 , β 시트 구조의 특징적인 피크 강도(196 및 217 cm -1 에서)에서 Aβ 원섬유는 저주파 자기장 하에서 BCFO 나노입자에 노출되었을 때 거의 절반으로 감소되었다. CD 스펙트럼의 베타 구조 선택(BeStSel) 알고리즘 분석 결과에 따르면, 자기전 처리는 Aβ 원섬유에서 β 시트 구조를 감소시킬 뿐만 아니라 무작위 구조를 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 S14). BCFO 나노 입자나 저주파 자기장만으로는 Aβ 원섬유의 기본 β 시트 구조에 영향을 미칠 수 없습니다. 또한 Aβ 파편에서 감소된 β 시트 구조가 자극 없이 37°C에서 72시간 배양 후에도 회복되지 않는 것을 관찰했습니다(그림 S15). 이러한 결과는 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자가 β 시트가 풍부한 Aβ 원섬유를 열역학적으로 안정한 무정형 아밀로이드 응집체로 해리,39 ). 

ThT 및 CD 분석 결과는 BCFO 나노입자의 자기전기적 결합 효과에 기인합니다. Aβ 원섬유의 해리에 대한 자기전기 촉매의 작용을 조사하기 위해 우리는 전자, 정공, 하이드록실 라디칼(•OH) 및 슈퍼옥사이드 이온(•O 2 - ) 을 포착하기 위해 다른 스캐빈저를 사용했습니다 (표 S1). 그림과 같이. S16에서, Aβ fibril의 β 시트 구조의 해리는 여기된 전자와 정공뿐만 아니라 BCFO 나노입자 표면의 •OH 및 •O 2 - 의 고갈에 의해 억제되었다. 스캐빈저 자체는 Aβ 원섬유의 β 시트 구조의 양을 변경하지 않았습니다(그림 S16). 우리의 결과는 Aβ 원섬유의 해리가 생성된 자유 라디칼 종(•OH 및 •O용액 내 용존 산소 분자로의 전하 이동에 의해 생성된 2 - )(그림 S17)( 40 ).

문헌(41-43)에 따르면 , 자유 라디칼 종은 구조적 불안정성을 유도하기 위해 Aβ 펩티드에서 전자를 빼앗아 Aβ 원섬유의 아미노산 서열을 번역 후 변형할 수 있습니다. 예를 들어, Aβ 펩타이드의 히스티딘(His 6 )은 •OH 및 •O 2 - 의 작용에 의해 2-옥소-히스티딘으로 전환될 수 있으며 (그림 S18), 메티오닌(Met 35 )도 메티오닌 설폭사이드로 산화될 수 있습니다. 자유 라디칼 종(그림 S19)( 44 ). Aβ 펩타이드의 히스티딘과 메티오닌이 각각 Aβ 원섬유에서 외부 β 가닥과 축 구조를 구성함에 따라 ( 45 – 48), 이러한 아미노산 잔기의 산화는 Aβ 피브릴 구조를 분해할 수 있습니다. Aβ 원섬유의 산화 발생을 조사하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-비행 시간 질량 분석(MALDI-TOF-MS)을 통해 Aβ 원섬유의 질량 대 전하( m / z ) 분포를 수집했습니다. 분석(그림 S20). BCFO 나노입자 또는 저주파 자기장이 없는 경우, Aβ 원섬유는 m / z 4516(Aβ 42 + H + )에서 강한 피크를 나타냈으며, 이는 원시 Aβ 펩타이드의 전형적인 분자량을 나타냅니다. 대조적으로, 자기전기 처리 후 Aβ 원섬유는 m / z 4531(Aβ42 + 오). 또한, 레이저 유도 단편화를 사용한 추가 MALDI-TOF-MS 분석 결과는 산화된 아미노산 잔기가 Met 35 이고 Met 35 의 28.7%가 자기전기 처리 후 메티오닌 설폭사이드로 전환되었음을 시사했습니다(그림 S21). 생성된 메티오닌 설폭사이드의 양(28.7%)은 자기전기 해리 후 Aβ 원섬유를 구성하는 산화된 Aβ 펩타이드(30.0%)의 양과 매우 유사합니다(그림 S22). 함께, 우리의 결과는 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자가 구성 Aβ 펩티드의 Met 35 산화를 유발함으로써 Aβ 원섬유의 β 시트 구조를 해리할 수 있음을 보여줍니다. 

BCFO 나노입자의 신경 생체 적합성을 조사하기 위해 우리는 신경퇴행성 질환 연구를 위한 일반적인 신경모세포종 모델인 SH-SY5Y 세포주에 대해 LIVE/DEAD 및 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 테스트했습니다( 49 ). LIVE/DEAD 분석은 형광 프로브[calcein acetoxymethyl ester(calcein-AM) 및 ethidium homodimer-1(EthD-1)]( 50 ) 및 CCK-8 분석 을 사용하여 살아있는 세포(녹색)와 죽은 세포(빨간색)를 시각적으로 구별합니다. 

는 수용성 포르마잔 생성물을 기반으로 하는 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소 활성을 평가하기 위한 비색 방법입니다( 26 ). 우리는 SH-SY5Y 세포를 BCFO 나노 입자와 함께 배양하고 각각 1일 및 7일 배양 후 세포에 LIVE/DEAD 분석을 적용했습니다. LIVE/DEAD 분석 결과에 표시된 대로(도 5A ), 대부분의 SH-SY5Y 세포는 배양 7일 후에도 녹색 형광(살아있는 상태, 세포내 에스테라아제의 정상 활성)을 방출하였다. 또한, 살아있는 세포 합류(즉, 캡처된 이미지에서 녹색 영역의 백분율)가 BCFO 나노 입자가 있는 경우 8.9%(1일차)에서 58.7%(7일차)로 증가했습니다(그림 S23). , 건강한 상태에서 SH-SY5Y 세포의 배가 시간(약 2일)에 해당합니다(대조 조건을 사용한 LIVE/DEAD 분석에 대한 그림 S24 참조)( 51 ). 명시야 이미지는 BCFO 나노 입자를 검은 점으로 보여줍니다( 그림 5B그리고 무화과. S25) SH-SY5Y 세포의 손상되지 않은 신경돌기 파생물과 접촉했습니다(그림 S26). BCFO 나노입자의 신경 생체적합성은 긴 신경돌기 파생물이 있는 분화된 SH-SY5Y 세포에서도 관찰되었습니다(그림 S27). 또한, CCK-8 분석 결과는 최대 500μg ml -1 의 BCFO 나노입자에서 SH-SY5Y 세포의 90% 이상의 생존율을 나타냈다( 도 5C 참조).그리고 무화과. 분화된 SH-SY5Y 세포에 대한 S28) 및 저주파 자기장 조사에 대한 BCFO 나노입자의 무시해도 될 정도의 세포독성 효과. 이러한 생화학적 분석 결과는 자기전기 처리가 세포 내 에스테라제 및 미토콘드리아 탈수소효소와 같은 세포 단백질의 기능에 심각한 손상을 일으키지 않았음을 의미합니다(그림 S30). 종합적으로, 우리의 LIVE/DEAD 및 CCK-8 분석 결과는 자기전기 BCFO 나노입자의 신경 생체 적합성을 시사합니다.



우리는 BCFO 나노 입자가 Aβ 응집체의 신경 독성을 완화할 수 있다고 가정했습니다. BCFO 나노입자의 완화 효과를 조사하기 위해 SH-SY5Y 세포에 CCK-8 assay를 적용하였다( Fig. 5D ). SH-SY5Y 세포를 성숙한 Aβ 원섬유(20μM)와 함께 배양했을 때 세포 생존율은 53.2%로 감소했습니다. BCFO 나노입자(100 μg ml -1) 또는 저주파 자기장(1kHz 및 13.6mT). 다른 한편, 우리는 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자에 의해 해리된 Aβ 원섬유와 함께 인큐베이션 후 세포 생존율이 최대 85.0%까지 유의하게 회복되는 것을 관찰했습니다. 우리는 이 결과를 Aβ 원섬유 구조의 분해에 기인합니다. 문헌( 52 , 53 )에 따르면, 신경 세포막에 불용성 Aβ 원섬유의 축적은 활동 전위 비동기화 및 막 투과를 유도하여 미토콘드리아 기능 장애 및 신경 세포 사멸을 포함한 병리학적 다운스트림 결과를 유발할 수 있습니다. 우리의 결과는 BCFO 나노입자와 저주파 자기장이 AD 뇌 조직에서 Aβ 원섬유뿐만 아니라 신경독성 Aβ 플라크를 치료할 가능성이 있음을 시사합니다. 

Aβ 플라크는 뇌 조직의 세포외 공간에서 Aβ 원섬유와 생물학적 성분(예: 지질, 단백질, 금속 이온) 사이의 복잡한 조립 과정에 의해 형성된 마이크로미터 크기의 고차 응집체입니다( 37 ). 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자의 Aβ 플라크 제거 효능을 조사하기 위해, 우리는 형질전환 AD 마우스 모델(5xFAD, 4개월령)의 생체외 뇌 조각을 사용했습니다. BCFO 나노 입자(100μg ml -1 )와 저주파 자기장(13.6mT 및 1kHz)을 생체 외 뇌 조각에 6시간 동안 적용했습니다( 그림 6A , 실험 설정은 그림 S31 참조). Aβ 플라크를 강조하기 위해 우리는 티오플라빈 S(ThS)를 사용하여 처리된 뇌 조각을 염색했습니다 .). 도 6B 에 나타낸 바와 같이 , 처리 전의 뇌 절편의 대뇌 피질 영역은 133.1 mm -2 의 밀도를 갖는 상당한 양의 Aβ 플라크로 덮였다 . BCFO 나노 입자 또는 저주파 자기장 처리 후 뇌 조각도 처리되지 않은 뇌 조각과 유사한 Aβ 플라크 분포를 나타냅니다(그림 S32). 그러나, 우리는 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자를 채택한 후 대뇌 피질 영역에서 Aβ 플라크의 밀도가 133.1에서 26.4mm-2로 급격히 감소한다는 것을 발견했습니다 ( 그림 6C). 우리의 면역조직화학 분석 결과는 또한 AD 마우스 모델의 생체외 뇌 조각에 대한 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자의 Aβ 제거 효능을 보여주었습니다(그림 S33). 또한, 우리는 자기전기적으로 처리된 뇌 조각이 Nissl 염색 결과에 따라 형태와 뉴런 분포에 큰 변화를 나타내지 않았음을 관찰했습니다(그림 S34). 결과는 나노미터 두께의 Aβ 원섬유를 해리할 수 있는 자기전기적으로 여기된 BCFO 나노입자가 알츠하이머병의 주요 병리학적 특징인 마이크로미터 크기의 Aβ 플라크를 제거하는 데에도 사용될 수 있음을 보여줍니다.